人胰島素(INS)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明書
實驗原理 ：
本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 。往預先包被有人胰島素(INS) 捕獲抗體的微孔中， 依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體，HRP 酶結合物，中間經過溫育和洗滌，用底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素 (INS) 呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度 (OD 值) ，計算樣品濃度。
操作步驟 ：
1. 從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照 100 μ l 每孔加入相應孔中，空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時。 (建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標板內測試。從 而減少基質效應對測試結果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和 標準品在檢測中建議設立復孔) 。
3. 加生物素化抗體：取出酶標板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100 μL，蓋上封 板膜后 37℃溫育 1 小時。
4. 洗板：棄去液體，每孔加入 300 μL 1x 洗滌液，靜置 1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板
3 次 (也可用洗板機洗板) 。
5. 加酶結合物工作液：每孔加入酶結合物工作液 100 μL，蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。
6. 洗板：棄去液體按步驟 4 洗滌方法，洗板 5 次。
7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90 μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育 15 分鐘。
8. 加終止液：取出酶標板，每孔直接加入終止液 50 μL，立即在 450nm 波長處測定各孔的OD 值。
結果判斷：
1. 計算標準品和樣本復孔的平均 OD 值并減去空白孔的OD 值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標， 在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。
2. 若樣品OD 值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
典型數據和參考曲線：
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。
濃度 (ng/mL) | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.312 | 0. 156 | 0 |
OD 值 | 2.22 | 1.56 | 0.92 | 0.63 | 0.42 | 0.25 | 0. 18 | 0.08 |
| 2. 14 | 1.48 | 0.94 | 0.55 | 0.34 | 0. 17 | 0.1 |
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試劑盒性能 ：
1. 重復性：板內變異系數小于 10%，板間變異系數小于 10%。
2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入 3 個不同濃度水平的人 INS，計算回收率
樣本類型 | 范圍 | 平均回收率 |
血清 (n=8) | 84- 101 | 96 |
血漿(n=8) | 92- 105 | 102 |
細胞培養上清(n=8) | 96- 108 | 105 |
3. 線性稀釋：分別在選取的 4 份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人 INS，在標準曲線動力學范圍
內進行稀釋，評估線性。評估線性。
本試劑盒只能用于科學研究，不得用于醫學診斷 6
稀釋比例 | 回收率 (%) | 血清 | 血漿 | 細 胞 培養 上 清 |
1 ：2 | 范圍 (%) | 84-95 | 88-96 | 90- 110 |
平均回收率 (%) | 91 | 93 | 96 | |
1 ：4 | 范圍 (%) | 89- 103 | 87- 108 | 105- 115 |
平均回收率 (%) | 94 | 98 | 108 |
注意事項：
1. 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫 20-25℃ 。使用
后立即冷藏保存試劑。
2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD 值。
4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。
5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑
的生物活性。
9. 不能使用過期產品。
10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
